一、實驗目的： 掌握PCR反應的基本原理與實驗技術

二、PCR反應實驗原理
   PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈式反應，可以選擇性擴增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時，就可以合成模板DNA的互補鏈，反應完成后，將反應混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應。這種延伸-變性-退火-延伸的循環可以重復多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合.
3. 延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向復制出互補DNA。
   上述3步為一個循環，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經過一個循環，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過25～30個循環后DNA可擴增10⁶～10⁹倍。
    典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩沖液、dNTPs、MgCl₂、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。
三、 試劑和緩沖液
PCR mix，10×PCR Buffer，引物，模板。
四、 儀器耗材
PCR儀，掌上離心機，微量移液器，槍頭，1.5mL離心管，PCR管，冰盒。
五、 實驗步驟（每人一組，每人做1管，純化時兩人一組）
1. 查找基因序列，設計合成PCR引物。注意合成引物約需一周時間，請提前準備。詳細步驟請參考實驗一后面的附件內容。
2. 在50μL反應體系中，加入：
　　　　模板DNA (5ng/μL)        1   
　　　　引物P₁P₂ (10μmol/L)    各1   
　　　　2×PCR mix              25 
　　　　ddH₂O                  22 
在冰上配制，注意混勻后離心。加入10μL石蠟油覆蓋。
3. 在PCR儀中預變性94℃ 4min，然后循環：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30個循環；循環結束后，72℃10min 。擴增的PCR產物4℃保存。（OC-II）
4. 取PCR產物2-5μL與上樣緩沖液混合，點樣。
5. 1% 瓊脂糖膠電泳，160V 30-40min。
　　6. 電泳結束，溴化乙錠染色5-10分鐘。
7. 用凝膠成像儀觀察、拍照。
8. PCR產物切膠回收。步驟參見膠回收Kit說明書。
A 酶切片段的純化及其回收
使用切膠回收kit進行PCR產物的回收。具體操作步驟如下，詳見說明書。
1）稱回收的膠，每0.1g加100µL XP2 ；
2）55度5-7分鐘至溶膠 ；
3）取溶膠液加入回收柱子，最大體積700µL；10000g, 1min；
4) 加300µl XP2 ，10000g 1min；
5）加700µl SPW ，10000g 1min；
6）重復5）；
7）空管離心2min，13000 g
8）干燥，加15-30µL  Eulation Buffer
9）13000 g，1min
 
DNA產物純化kit，操作步驟：

• 將PCR反應液（40ul）或酶促反應液移至一干凈的1.5ml離心管中，加入5倍體積的buffer3，充分混勻。（用前確定加入適量的異丙醇）

• 將混合液全部移入吸附柱，8000g離心30s；將濾出液再次加入到吸附柱中再次過柱，8000g離心30s（此步驟可以提高回收效率）；倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中。

• 向吸附柱中加入500ul Wash Solution（加到壁上），9000g離心30s。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中。（Wash Solution使用前請檢查是否已加入正確量的無水乙醇）

• 重復步驟3一次

• 將空吸附柱和收集管放入離心機，9000g離心1min。下管扔掉，上管放入1.5ml離心管中，晾干。（殘余的乙醇會嚴重影響得率和后續試驗）

• 在吸附膜中央加入25ul 60℃提前預熱（進一步提高得率）的Elution Buffer（加到濾芯上），室溫靜置1min，9000g離心1min。將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續試驗。

注意：本步驟中，所有轉速單位為g。

B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法對PCR產物回收。具體操作步驟如下。

• 加入等體積的冰無水乙醇，加入1/10體積的KAc（3M  pH5.2）。

• 上下顛倒混勻，-20℃30min；12000r/min 4℃ 10min。

• 棄上清，加入70%的冰乙醇，輕輕混勻。12000r/min 4℃離心10min。

• 棄上清，室溫干燥，至無乙醇。

• 加入適量體積的ddH2O。

六、注意事項

1. 進行PCR反應時，注意加入試劑的順序。注意加入任何一種試劑后均需混勻。
2. 本實驗使用2xPCR mix，包含有dNTPs和Taq酶。
3. 引物的稀釋：分子量24bp*324.5 = 7788，質量數10OD*33 ＝33ug，摩爾數=33/7788 =4.2 nmol，母液濃度4.2 n mol / 84μL H₂O = 50μmol/L，使用時取母液稀釋5倍，則終濃度為10μmol/L。
4. PCR擴增產物共20μL，其中2-5 μL用于檢測，剩余的用于純化回收。
5. 使用自己的實驗材料進行PCR擴增的學生，請提前準備引物和模板。

 

附1：基因序列查找和PCR引物設計

實驗課進行之前，需要利用NCBI查找基因序列，并設計PCR引物。

• 進入NCBI（后，在Search的下拉框中選擇Nucleotide，再輸入基因名稱，點擊Search即可。也可輸入具體的物種名以縮小范圍，獲得cDNA 序列信息。

例如：水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因（Oryzacystatin, OC）序列信息
OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCGTTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGATGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGGCCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAACAGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGGGCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTACGAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCCTCGACGACGCCACCGCCTAA

• 引物設計。要求擴增上述完整的cDNA 序列，并在兩端添加酶切位點，5‘添加EcoRI（GAATTC）， 3‘端添加HindIII （AAGCTT）。以便克隆到pET30a的相應位點。

注意PCR產物中沒有上述酶切位點，否則不能使用。
prim-OC2-R   GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC    26bp  下劃線為EcoRI識別序列
#prim-OC2-F   GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC    26bp  下劃線為HindIII 識別序列
 
T載體通用引物
B0012 (M13-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
B0014 (M13-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA