CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測的方法

CCK-8法是細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性檢測常用的一種檢測方法，其具體操作方法如下：
1.制備細(xì)胞懸液：選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。
2.在96孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 μL/孔)。
3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃，5% CO2）12-24小時(shí)，使細(xì)胞達(dá)到指數(shù)期（培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異）。
4.吸出各孔培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測藥物進(jìn)行干預(yù)。（實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物培養(yǎng)基）
5.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)，具體時(shí)間一般根據(jù)細(xì)胞周期來決定）。
6.每孔加入10ul CCK-8試劑。①在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收。如果實(shí)驗(yàn)中待測物質(zhì)有氧化還原劑，在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入藥物，然后加入CCK-8試劑在一定時(shí)間內(nèi)檢測，和不加藥物的培養(yǎng)基進(jìn)行比較（只加CCK-8試劑），如果OD值明顯偏高，則說明有反應(yīng)。
②可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物對實(shí)驗(yàn)的影響。
③當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。5.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時(shí)：
6.使用酶標(biāo)儀檢測450nm波長的吸光度（OD值）按公式計(jì)算：
細(xì)胞活力（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
細(xì)胞抑制率（%）=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 實(shí)驗(yàn)組吸光度 (含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液)；
Ac: 對照組吸光度 (含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物)；
Ab: 空白組吸光度 (含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細(xì)胞、藥物)。

 
CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞活力指細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性檢測時(shí)的注意事項(xiàng)：
 
由于CCK-8是通過和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量，如果細(xì)胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細(xì)胞數(shù)量將會比真實(shí)值高，不能真實(shí)反映活細(xì)胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。
 
由于 CCK-8 分析基于活細(xì)胞中脫氫酶活性的檢測，因此影響活細(xì)胞中脫氫酶活性的條件或化學(xué)物質(zhì)可能會導(dǎo)致實(shí)際活細(xì)胞數(shù)與使用 CCK-8 分析確定的細(xì)胞數(shù)之間存在差異。
 
考慮到不同類型細(xì)胞代謝水平存在差異，有些細(xì)胞在藥物處理后，可能活細(xì)胞數(shù)不變，但是有氧代謝能力降低后，NAD+產(chǎn)生減少，測出的Formazan也會減少。
 
CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。
 
在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測定的過程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。
 
金屬對CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會*抑制。
 
CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成干擾，可以通過減去空白孔中本底的吸光度而消除。
 
混合或重懸組分時(shí)，避免產(chǎn)生氣泡，因?yàn)樗鼈儠绊慜D值讀取。
 
剛開始做實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。
 
CCK-8反復(fù)凍融會增加背景值，干擾實(shí)驗(yàn)測定。
CCK8的說明書大家一定要認(rèn)真閱讀，里面很多細(xì)節(jié)的問題都有提到。而且說明書里提供的一些關(guān)于各種細(xì)胞的種板數(shù)都很有參考價(jià)值，因?yàn)槟鞘欠磸?fù)驗(yàn)證過的最佳數(shù)值。
CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測的優(yōu)勢：

1、使用方便，CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，可以直接加入到細(xì)胞樣品中（懸浮和貼壁細(xì)胞均適用），不需要預(yù)配各種成分，不需要對細(xì)胞進(jìn)行過多的處理，也不必添加放射性同位素、有機(jī)溶劑等，且能夠快速進(jìn)行檢測；
2、CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；
3、CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法，MTT 實(shí)驗(yàn)生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機(jī)溶劑溶解；
4、而本方法產(chǎn)生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差；
5、CCK-8法對細(xì)胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時(shí)間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；
6、CCK-8 對細(xì)胞的毒性非常低，其他的實(shí)驗(yàn)，例如中性紅法或結(jié)晶紫法 ，也可在 CCK-8 法檢測完后繼續(xù)進(jìn)行。
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